Este estudio realizó la secuenciación del genoma completo de un paciente con neuropatía de Charcot-Marie-Tooth y su familia. Se identificaron dos mutaciones en el gen SH3TC2: una mutación sin sentido R954X y una mutación con cambio de sentido Y169H. Los individuos que tenían ambas mutaciones presentaban CMT, mientras que los que tenían solo Y169H tenían neuropatía axonal y los que tenían solo R954X tenían síndrome del túnel carpiano. La secuenciación del genoma ayudó a comprender

1. Whole-GenomeSequencing in a PatientwithCharcot-Marie-ToothNeuropathy James R. Lupski, M.D., Ph.D. By: Daniel Estrada Muñoz Universidad Pontificia Bolivariana Facultad de Medicina

2. Introduction A genetic study of disease based in the genetic sequencing, allows to know the problem at the source, looking to raise an specific solution or at least a better way to treat people with the disease. Charcot-Marie-Tooth disease has no cure, but knowing the sequence of it in the patients, allows to identify clinical variables for a better patient care.

3. Peripheral Neuropathy This Comes from the Greek words, “neuro” that means nerves and “pathy” that means abnormal. There are 2 types of nerves, the ones that relay information from the CNS to the periphery, and the nerves that relay information from the periphery to the CNS

4. Peripheral Neuropathy Peripheral neuropathy occurs when these nerves don’t work properly, and this can cause several symptoms like pain, loss of sensation, inability to control muscles and others.

5. Charcot-Marie-Tooth Disease Group of inherited disorders that affect the peripheral nerves. It has been detected at least in 14 genes, causing different types of disease. Symptoms usually begin in the lower limb

6. Charcot-Marie-Tooth Disease CMT has two forms: Type I Involves damage to the myelin sheath around the axon, in some cases the total destruction of this sheath. Type II In this type the axon of the neuron wears away

7. Sequencing Detailed analysis of the genetic structure to determine the order of nucleotides (A, T, G and C) in a DNA sequence.

8. Relation Sequencing/CMT The DNA of patients with Charcot-Marie-Tooth was sequenced to note what mutation in the genetic material made possible the development of the disease.

9. General Objective Show the results of the sequencing of CMT to understand the manifestation in patients.

10. Materiales y Métodos

11. Pacientes El estudio se realizo en una familia de 10 integrantes. Madre, padre 4 hermanos afectados y 4 hermanos no afectados con CMT tipo I.

12. Diagnostico El diagnostico del paciente control y de sus tres hermanos afectados se realizo por examen físico y estudios electrofisiológicos.

13. Examen físico Debilidad y atrofia de músculos distales Pes cavus Ausencia de reflejos osteotendinosos

14. Estudios de Conducción Nerviosa Respuesta motora del nervio mediano, ulnar, tibial y peroneo con latencias de ondas F. Potencial sensitivo ortodrómico del nervio mediano ulnar y sural. Reflejos H tibiales bilaterales.

15. Secuenciación SOLiD Sequencing by oligonucleotide ligation a detection. Es una secuenciación por ligación de octámeros marcados de secuencia conocida a la cadena de DNA con posterior detección de la señal fluorescente emitida tras caga ligación.

16. Hibridación Para una hibridación genómica comparativa basada en matrices y un análisis de el numero de copias variantes en el paciente estudiado se compara con las variantes que posee un hombre control.

17. SNP-Single Nucleotide Polymorphism El paciente estudiado tiene un total de 3.420.306 SNP de los cuales en los cuales hay 121 mutaciones sin sentido y 27 mutaciones en las cuales se cambia el codón Stop por cualquier otro codón.

18. Polymerase Chain Reaction. PCR Por medio de PCR se amplificaron los exones 5 y 11 del gen SH3TC2 y se secuenciaron directamente en todos los miembros de la familia en estudio. Para verificar la mutación de aminoácidos Arg954ter (R954X) que corresponde a una mutación de GA en el DNA genómico en el exón 11 del gen SH3TC2 en el cromosoma 5.

19. Polymerase Chain Reaction. PCR Se generó también un fragmento de PCR de 312 Pb que se incubo con la enzima de restricción TaqI. La mutación del nucleótido resulta en la eliminación del punto de restricción para esta enzima. Esta enzima hace cortes pegajosos entre T y C.

20. RESULTADOS

21. En adicion al fenotipo de CMT se encontro por medios electrofisiologicos una neuropatia axonal en un padre y un abuelo del individuo estudiado. Ademas se encontromononeuropatia del nervio mediano en la muñeca MMM en todos los abuelos y ambos padres sin embargo con un patron de herencia poco claro. Estudios de Conducción Nerviosa

22. Estudios de Conducción Nerviosa Se hayan tres tipos de MMM. El Abuelo carpintero con un fenotipo normal pero MMM severa. Abuela y madre con una MMM leve. Y una MMM severa asociada con una polineuropatía axonal. Esta ultima es similar a la neuropatía heredada atribuida a la haploinsuficienda de PMP22. La duplicación de este gen causa CMT tipo IA, la forma mas comun.

23. Variación Genética Se encontraron 3.420.206 SNPs Se usaron dos enfoques para determinar el numero de copias variantes. Se identificaron 234 variantes en un rango de tamaño de 1690 pb a 1.627.813 pbpero ninguna con relacion a neuropatias.

24. Variación Genética Se observo entonces los SNP no-sinonimos detectados por la secuencia completa comparados con una base de datos de mutaciones previamente observadas. De las 174 SNP no sinomimos 159 tenian rasgo hereditario. De estas, 21 causaban enfermedades mendelianas. De estas 16 eran heterocigoticas.

25. Variación Genética Las 5 homocigoticas que sobraron eran errores de asignacion de mutaciones de enfermedad lo que explica porque 4 de ellos son homocigoticos en el examen pero no estaban afectados.

26. Variación Genética Se examinaron mutaciones en 40 genes relacionados con neuropatias. Esto dio como resultado 3148 SNPs de los cuales 54 codificaban. De estas 54, 2 estaban en el locuas de SH3TC2 y eran una mutacion con cambio de sentido y una mutacion sin sentido.

27. Variación Genética La mutacion sin sentido R954X ya se habia implicado con CMT La mutacion con cambio de sentido (AG en el cromosoma 5 en el nucleotido 148.402.474) corresponde a la mutacion del aminoacido Tyr169His (Y169H)

28. Relacion Genotipo/Fenotipo Se analizaron las mutaciones por separado pero se comprobo que solo los hijos (4) que presentaban los dos alelos mutados poseian CMT. Se encontroTambien que los que poseian la mutacion Y169H tenian una neuropatia axonal. Mientras que la mutacion R954X se asocia con el sindrome del tunel del carpo sin importar si estaba solo o con el otro alelo mutante.

30. A Representa el Familiograma, se muestra de color negro los individuos afectados con CMT y de color gris los que tienen neuropatía axonal. Solo los individuos con los dos alelos mutados presentan la enfermedad. Los que tienen solo el alelo Y169H presentan neuropatia axonal Los que tienen solo el alelo R954X presentan sindrome del Tunel del Carpo.

31. B Muestra el resultado de la enzima de restriccion TaqI. La mutacion elimina el sitio de corte de la enzima. Los individuos no mutados presentan dos bandas mientras que los individuos que tienen la mutacion R954X presentan tres bandas de las cuales la de arriba representa el DNA no cortado.

33. C Muestra la representacion de aminoacidos de la proteina SH3TC2 en varias especies. Se muestra el lugar donde ocurre la mutacion Y169H.

34. DISCUSIÓN

36. Conclusions There are cases when 2 different mutations combine to develop a disease. The protein SH3TC2 is necessary to the order of ranvier nodes without this the patient present malfunction conduction. Sequencing diseases can help to the diagnosis of the primer cause of the disease, so the tratment can be more effective. Although the mutations are the same, the fenotype in each patient is different, one could be harder than another one.